Ферменты, используемые в генной инженерии.

Основные понятия и сокращения 3
Краткая аннотация 3
Ключевые слова: 3
Key words: 3
Введение 3
Ферменты, используемые при конструировании рекомбинантных ДНК, делятся на определенные группы 4
Рестриктазы 5
Полимеразы 9
Обратная транскриптаза 11
Лигазы 13
Терминальная трансфераза 14
Терминальная дезоксинуклеотидтрансфераза 16
Фрагмент Кленов 16
Заключение 18
Список литературы 19
Ссылки на иллюстративный материал 20

Весь текст будет доступен после покупки

Генная инженерия - происходит от раздела молекулярной генетики при слиянии таких разделов, как «генетическая энзимология» и «химия нуклеиновых кислот», поскольку ферменты являются инструментами молекулярного дизайна и манипулирования. Основная проблема заключается в размерах макромолекул ДНК и РНК, что сильно усложняет работу с ними. Ферменты решают эту проблему.
Они способны «разрезать» или, наоборот, «зашить» дырку в цепи ДНК, найдя определенные последовательности нуклеотидов. Эти эпохальные ферменты уже давно находятся в клетке, выполняя свою работу по репликации, восстановлению ДНК, чтению и передаче информации из одной клетки в другую. Основная цель специалиста в области генной инженерии — подобрать нужный фермент, способный выполнить поставленную задачу, взаимодействуя с определенным участком нуклеиновой кислоты.

Весь текст будет доступен после покупки

Ферменты, используемые при конструировании рекомбинантных ДНК, делятся на определенные группы
- ферменты, из которых получают фрагменты ДНК- рестриктазы;
- ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);
- ферменты, объединяющие определенные фрагменты ДНК (лигазы);
- ферменты, дающие возможность осуществить определенные изменения структуры концов фрагментов ДНК.


Рестриктазы

[1]
Ферменты рестрикции (эндонуклеазы рестрикции, эндонуклеазы рестрикции) — это ферменты, которые узнают и атакуют определенные нуклеотидные последовательности в молекуле ДНК (сайты рестрикции).
Еще в 1953 г. было установлено, что ДНК одного штамма кишечной палочки, введенная в клетки другого штамма (например, ДНК штамма B в клетки штамма С), как правило, не проявляет генетической активности, т.к. он быстро распадается на мелкие фрагменты. В 1966 г. было показано, что это явление связано со специфической модификацией ДНК хозяина — она содержит несколько метилированных оснований, отсутствующих в немодифицированной ДНК, а метилирование (присоединение метильной группы к основанию) происходит после завершения репликации. Бактерия способна отличить собственную ДНК от любой вторгшейся «чужой» именно по типу ее модификации. За «метку» отвечают метилирующие ферменты модификации, так называемые ДНК-метилазы. Различие в модификации делает чужеродную ДНК восприимчивой к действию рестрикционных ферментов, распознающих отсутствие метильных групп в соответствующих сайтах.
Системы рестрикции и модификации широко распространены у бактерий; их существование играет важную роль в защите резидентной ДНК от контаминации последовательностями чужеродного происхождения. Рестрикционный фермент, расщепляющий неметилированную ДНК, был выделен в 1968 г. Мезельсоном и Юанем. Этот фермент обладал высокой специфичностью по отношению к определенной последовательности ДНК, но расщеплял молекулы неспецифически, в другом месте, на некотором расстоянии от места узнавания. Вскоре, в 1970 г., Смит и Уилкокс выделили из Haemophilus influenzae первый рестрикционный фермент, расщепляющий строго определенную последовательность ДНК (Hind III). Поскольку разные бактерии маркируют свою ДНК по-разному, ферменты рестрикции также должны распознавать разные последовательности. Действительно, с тех пор были выделены рестрикционные ферменты, которые распознают более 150 сайтов рестрикции (сайтов расщепления ДНК).

Изменение специфичности действия рестриктаз в неоптимальных условиях.
Ферменты рестрикции являются высокоспецифичными ферментами. Однако для сохранения этой специфичности in vitro необходимо поддерживать в реакционной смеси оптимальные условия для действия ферментов. При нарушении этих условий некоторые рестриктазы начинают проявлять вторичную (так называемую точечную) активность. Эндонуклеаза рестрикции EcoRI расщепляет последовательность GAATTC при pH 7,3, 100 мМ NaCl в присутствии 5 мМ MgCl2, более короткую последовательность AATT (так называемая активность EcoRI). Ферменты рестрикции со сходными свойствами также включают BamHI, BstI, BsuI, DdeI, HhaI, PstI, SalI, SstI, XbaI.
Действие рестриктаз на необычные субстраты. Помимо двухцепочечной ДНК, многие рестриктазы способны использовать в качестве субстрата гибриды ДНК-РНК. Это относится, в частности, к ферментам рестрикции EcoRI, HindII, SalI, MspI, HhaI, AluI, TaqI и HaeIII. Некоторые рестрикционные ферменты, такие как HaeIII, HhaI и SfaI, способны расщеплять одноцепочечную ДНК fX174, хотя и намного медленнее, чем соответствующая двухцепочечная форма RF. Эта способность была продемонстрирована для нескольких других рестриктаз, а также ДНК-субстратов. Остается неясным, распознают ли эти рестриктазы настоящие одноцепочечные сайты или нуклеотидные последовательности, содержащиеся во вторичных строительных блоках.
С развитием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (см. ниже) часто возникает необходимость обработки амплифицированных олигонуклеотидов на их концах ферментами рестрикции, т.е. расщепления H.HRS. в условиях, при которых сайт рестрикции фланкирован на одном из своих концов одним или несколькими нуклеотидами. Обнаружена четкая зависимость способности некоторых рестриктаз расщеплять сайты рестрикции от числа нуклеотидов, фланкирующих сайт. Это свойство рестрикционных ферментов можно объяснить, в частности, тем, что двойная спираль ДНК плавится локально на самых концах двухцепочечной молекулы ДНК, в результате чего образуются короткие одноцепочечные участки, захватывающие место узнавания. с помощью ферментов рестрикции. Локального плавления можно частично избежать, если снизить температуру реакционной смеси при рестрикции таких олигонуклеотидов.
Каким образом субстрат влияет на активность рестриктаз?
Эндонуклеазы рестрикции часто используют сразу после реакции ПЦР. Следует помнить, что как буферный раствор, используемый для амплификации, так и праймер могут существенно влиять на активность фермента. Например, было показано, что присутствие праймеров в концентрации 1 мкМ ингибирует ферменты рестрикции SmaI и NdeI (Ambrol, 1993). Однако в большинстве случаев наличие праймеров не влияет на эффективность расщепления даже при концентрации 100 мкМ. Если вас не устраивают результаты гидролиза молекулы ДНК, полученные после реакции ПЦР, необходимо провести деминерализационную хроматографию и диафильтрацию на мембранном фильтре. Это более быстрая процедура, чем экстракция ДНК смесью фенола и хлороформа с последующим осаждением спиртом.

Весь текст будет доступен после покупки

1. https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/5/58/EcoRV.png/240px-EcoRV.png
2. https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/d/d6/Taq_polimerase.png/220px-Taq_polimerase.png
3. https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/3/39/HIV-1_Reverse_Transcriptase_with_Active_Sites.png/220px-HIV-1_Reverse_Transcriptase_with_Active_Sites.png

Весь текст будет доступен после покупки