Разработка технологии получения ритуксимаба с помощью моноклональных тел и его применение в лечении онкологических и аутоимунных заболеваний

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 10
ВВЕДЕНИЕ 11
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
1.1 Классификации биотехнологических лекарственных препаратов 14
1.2 Моноклональные антитела 16
1.3 Общая характеристика фармакокинетики моноклональных антител 18
1.4 Общая характеристика нежелательных явлений моноклональных антител 19
1.5 Иммуногенность моноклональных антител 20
1.6 Современные методы получения моноклональных антител 20
1.6.1 Гибридомная технология получения моноклональных антител 20
1.6.2 Фаговая библиотека антител 22
1.6.3 Трансгенные животные-продуценты 23
1.6.4 Клеточные линии (CHO, HEK293) 25
1.7 Ритуксимаб: Характеристика, механизм действия и фармакологические свойства 26
1.7.1 Характеристика ритуксимаба 26
1.7.2 Структура и мишень ритуксимаба (CD20) 27
1.7.3 Фармакокинетика и иммуногенность 28
1.8 Клиническое применение ритуксимаба 29
1.8.1 Онкологические заболевания 29
1.8.2 Аутоиммунные заболевания 42
ОРГАНИЗАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 53
2.1 Объект исследования 53
2.2 Методы исследования 53
2.3 Процедура приготовления питательной среды для масштабирования Power CHO2 54
2.4 Процедура приготовления вспомогательных растворов 56
2.4.1. Приготовление буфера для глубинной фильтрации (0,9% натрия хлорида) 56
2.4.2. Приготовление буфера для глубинной фильтрации (50 трис, 150 мМ натрия хлорид, pH=7,5) 57
2.5. Процедура приготовления растворов для корректировки рН растворов 58
2.5.1. Приготовление 5М раствора гидроксида натрия (NaOH) 58
2.5.2. Приготовление 3 М раствора хлороводородной кислоты (HCl) 60
2.6. Проверка стерилизующего фильтра на целостность 63
2.7. Описание технологического процесса 64
2.7.1. Процедура размораживания криофлакона Ритуксимаб (П1). 65
2.7.2. Расчет параметров пересева клеточной культуры (П2- П7) 66
2.7.3. Параметры масштабирование клеточной культуры в колбах в инкубаторе на встроенном шейкере 68
2.7.4. Параметры масштабирования клеточной культуры в волновых биореакторах 10 л (пассаж 4) и 100 л (пассаж 5) 70
2.7.5. Параметры масштабирование клеточной культуры в осевом биореакторе 71
2.7.6. Параметры культивирования клеток Ритуксимаб– Продуктовый этап 73
2.7.7. Cоздание постпроизводственного банка клеток (EoPCB) 74
2.7.8. Глубинная фильтрация 76
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ВЫВОДЫ 78
ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 80

Весь текст будет доступен после покупки

На протяжении многих лет глобальное здравоохранение ведет борьбу с аутоиммунными реакциями, инфекционными заболеваниями и раком, которые остаются одними из основных причин смертности в мире. Однако, благодаря развитию технологий, появились лекарственные средства, способные существенно улучшить состояние пациентов с этими недугами. Речь идет о моноклональных антителах (мАТ). Благодаря своей избирательности и высокой эффективности, моноклональные антитела заняли значительную долю на фармацевтическом рынке, а объем их продаж только за 2024 год превысил 121,8 миллиарда долларов. При этом биотехнологическая отрасль активно продолжает исследования и разработки в этой области. Развитие данной группы препаратов не стоит на месте.
В последние годы ритуксимаб стал применяться при аутоиммунных процессах: ревматоидном артрите, болезни Шёгрена, системной красной волчанке (СКВ), антифосфолипидном синдроме, аутоиммунных цитопениях и т.д. Механизм действия ритуксимаба при аутоиммунных болезнях основан не только на уменьшении количества В-лимфоцитов и уровня IgG, но и на снижении экспрессии CD40 и CD80 на В-лимфоцитах, что тормозит активацию Т-лимфоцитов. Ритуксимаб может индуцировать элиминацию аутореактивных Т-лимфоцитов и восстанавливать аутотолерантность.
Целью выпускной магистерской диссертации является изучение особенностей получения ритуксимаба с использованием технологии моноклональных антител, а также анализ его клинического применения в терапии различных заболеваний, включая онкологические (например, неходжкинские лимфомы, хронический лимфолейкоз) и аутоиммунные патологии (ревматоидный артрит, системная красная волчанка). Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Создать методики приготовления буферов и корректирующих растворов с заданными значениями рН, необходимыми для поддержания оптимального химического состава среды культивирования.
2. Определить оптимальные условия культивирования клеток CHO: разработать схему пересева клеток, установить ключевые контролируемы параметры (температура, концентрация кислорода, уровень рН, жизнеспособность клеток и посевная плотность), необходимые для эффективного роста клеточной линии.
3. Проанализировать эффективность и безопасность ритуксимаба в лечении различных заболеваний на основе клинических исследований.
4. Предложить алгоритм перехода на продуктивную стадию культивирования, направленный на максимальное увеличение выхода целевого белка — Ритуксимаба.
5. Разработатать методику создания постпроизводственного банка клеток (EoPCB), обеспечивающую сохранность генетической стабильности клеточной линии и установление критериев её оценки после завершения производственного цикла.
Объект исследования: Моноклональные антитела, в частности ритуксимаб, как терапевтический препарат
Предмет исследования: Биотехнологические методы получения ритуксимаба, его фармакологические свойства и клиническая эффективность при лечении онкологических и аутоиммунных заболеваний.
Научная новизна работы:
1. Систематизация современных методов производства ритуксимаба;
2. Сравнительный анализ его эффективности при различных нозологиях;
3. Обзор новых исследований в области модификации препарата.
Практическая значимость работы:
1. Результаты исследования могут быть использованы в фармацевтической промышленности для оптимизации производства моноклональных антител.

Весь текст будет доступен после покупки

1.1 Классификации биотехнологических лекарственных препаратов
Биотехнологические лекарственные средства можно классифицировать по-разному (рис. 1). Один из основных подходов — классификация по структуре молекулы:
1. Моноклональные антитела, в том числе конъюгированные, по структуре напоминают природные антитела человека (иммуноглобулины G, IgG) и включают Fab- и Fc-фрагменты, а также лёгкие и тяжёлые цепи.
2. Fab-фрагменты антител могут быть модифицированы, например, путём пегилирования (присоединения полиэтиленгликоля).
3. Рекомбинантные Fc-слитые белки - это полученные искусственным путём белки, содержащие Fc-домен антитела.
Значительная часть моноклональных антител, разрешённых к применению в медицинской практике, по строению воспроизводят структуру естественных IgG человека. Их молекула – это симметричная структура, состоящая из двух идентичных тяжёлых и двух идентичных лёгких цепей, объединённых дисульфидными мостиками.
Существует четыре подкласса IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), которые различаются строением тяжёлых цепей [4-5]. Эти различия определяют, как антитело взаимодействует с иммунной системой через Fc-рецепторы. В клинической практике наиболее широко применяются препараты на основе структуры подкласса IgG1 (рис. 2).
В зависимости от степени схожести с белками человека, моноклональные антитела делят на несколько поколений. Первые разработанные препараты полностью состояли из мышиных иммуноглобулинов [6]. С появлением методов генной инженерии учёные научились создавать гибридные молекулы, заменяя части мышиного антитела на человеческие. Так появились химерные антитела (содержат свыше 65% человеческого белка), гуманизированные (до 95% человеческого белка) и полностью человеческие [7]. Особняком стоят наноантитела — принципиально новый класс, одобренный для применения в 2019 году. Их уникальность в том, что они состоят всего из одной белковой цепи и впервые были обнаружены у верблюдов, лам и акул [8].

Весь текст будет доступен после покупки

1. Анисимова, Г. В. Технология получения моноклональных антител / Г. В. Анисимова // Биотехнология. – 2020. – Т. 36, № 4. – С. 12–25.
2. Баранов, О. А. Основы биофармацевтического производства : учебное пособие / О. А. Баранов. – Санкт-Петербург : Профессия, 2021. – 512 с. – ISBN 978-5-939-56789-0.
3. Бахир, В. М. Современные биореакторы для культивирования клеток млекопитающих / В. М. Бахир, С. П. Медведев. – Москва : Академкнига, 2019. – 288 с. – ISBN 978-5-946-28123-4.
4. Белов, А. М. Контроль качества в биотехнологии : методы и подходы / А. М. Белов. – Новосибирск : Наука, 2017. – 401 с. – ISBN 978-5-020-34123-9.
5. Берг, К. Л. Клеточная инженерия: принципы и применение / К. Л. Берг, П. Р. Смит. – Москва : Мир, 2015. – 670 с. – ISBN 978-5-030-00456-7.
6. Биотехнология: учебник для вузов / под ред. А. В. Гарабаджиу. – Москва : ИКЦ «Академкнига», 2022. – 890 с. – ISBN 978-5-946-28234-7.
7. Богданов, Р. В. Анализ процессов культивирования CHO-клеток / Р. В. Богданов // Вестник биотехнологии. – 2021. – № 2. – С. 45–58.
8. Борисенко, Е. А. Глубинная фильтрация в производстве белковых препаратов / Е. А. Борисенко, М. И. Козлов // Химико-фармацевтический журнал. – 2019. – Т. 53, № 8. – С. 34–40.
9. Буторин, С. Г. Применение ритуксимаба в клинической практике / С. Г. Буторин // Клиническая фармакология и терапия. – 2018. – Т. 27, № 3. – С. 67–72.

Весь текст будет доступен после покупки